抗體常見問題之IHC
| 問題 | 原因 | 解決方案 |
|---|---|---|
| 邊緣效應(yīng) | 組織邊緣貼附不牢，邊緣組織松脫漂浮于液體中 | APES/多聚賴氨酸處理玻片；組織切片盡量薄；盡量避免選用壞死較多的組織 |
| 試劑未充分覆蓋組織 | 滴加試劑時讓試劑完全覆蓋組織 | |
| 非特異性染色體 | 抗體質(zhì)量問題 | 使用質(zhì)量有保證的抗體 |
| 抗體孵育時間長 | 減少孵育時間 | |
| 抗體濃度過高 | 降低抗體濃度 | |
| 一抗為多抗 | 使用單克隆抗體 | |
| 內(nèi)源性過氧化物酶及生物素 | 延長滅活時間 | |
| 封閉不足 | 延長封閉時間 | |
| DAB孵育時間過久或濃度過高 | 按說明書配置試劑，鏡下控制反應(yīng)時間 | |
| 抗體孵育后洗滌不充分 | 每次孵育之后洗3*5次 | |
| 滴加試劑時干片 | 及時滴加試劑 | |
| 切片在緩沖液中浸泡過久 | 抗原修復(fù)之后及時封閉加一抗，不能過夜 | |
| 陰性結(jié)果 | 抗體濃度及質(zhì)量 | 選擇有質(zhì)量保證的抗體，先做預(yù)實驗摸索抗體使用濃度 |
| 抗原修復(fù)不全 | 摸索合適的抗原修復(fù)方式及修復(fù)時間 | |
| 抗原豐度 | 正常陰性 | |
| 封閉時間過長 | 減少封閉時間 | |
| DAB孵育時間短 | 鏡下控制顯色時間 | |
| 細胞通透不全，抗體未能進入細胞反應(yīng) | 選擇合適的通透劑及其反應(yīng)時間 | |
| 一抗二抗不匹配 | 選擇正確來源的二抗 | |
| 脫片 | 玻片未處理好 | 玻片清洗干凈后用APES或多聚賴氨酸處理 |
| 切片厚薄不均勻 | 更換刀片；調(diào)整好切片機狀態(tài) | |
| 烤片時間或溫度不夠 | 60攝食度2小時 | |
| 組織自身問題 | 腫瘤壞死組織及骨組織本身易脫片 | |
| 抗原修復(fù)時溫度迅速變化 | 抗原修復(fù)后讓其自然冷卻 | |
| 操作時用力過猛 | 有脫片嫌疑的切片不要用力甩，用吸水紙吸干殘余液體 | |
| 染色弱 | 抗體濃度低，孵育時間短 | 提高抗體濃度，延長反應(yīng)時間 |
| 試劑使用超過有效期 | 試劑定時更新 | |
| 滴加試劑時殘余緩沖液過多使試劑稀釋 | 滴加試劑前盡量減少殘余液體 | |
| 封閉過度 | 減少封閉時間 | |
| 著色不均勻 | 切片厚度不一致 | 更換刀片；調(diào)整好切片機狀態(tài) |
| 試劑配制未混勻使局部濃度不一致 | 試劑充分混勻后滴加 | |
| 試劑未完全覆蓋組織 | 滴加試劑時讓試劑完全覆蓋組織 | |
| 脫蠟不完全 | 更換脫蠟劑或延長脫蠟時間 |